首页 >> 最新文章

大码服装实时荧光定量PCR原理

装沙机械网 2019-08-22 18:28:23

实时荧光定量PCR原理

所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.

1.在荧光定量PCR技术中,有一个很重要的概念——Ct值.C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示).

Ct值的确定

2.荧光域值(threshold)的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold=10SDcycle6-15

3.Ct值与起始模板的关系

研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕,起始拷贝数越多,Ct值越小.利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值(如图2所示).因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数.

荧光定量标准曲线

4.荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料〔2〕.现将其原理简述如下:

1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步.如图3所示.

TaqMan荧光探针工作原理

2)SYBR荧光染料:

在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步.

北京市东城区新景家园3室2厅2卫114m2户型图

新中式案例中式风格两室一厅装修效果图

新房装修效果图

友情链接